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布鲁氏杆菌PCR检测试剂盒

布鲁氏杆菌PCR检测试剂盒
【产品名称】
     通用名称:布鲁氏杆菌PCR检测试剂盒
     英文名称:Diagnostic Kit for Brucella (PCR)
【预期用途】
本试剂盒主要用于检测各种疑似布病动物样品中的布鲁士杆菌(Brucella),适用于布鲁氏杆菌的检测、诊断和流行病学调查。
【检测原理】
    本试剂盒针对布鲁氏杆菌特有基因片段设计特异性引物,采用柱式法提取DNA,并以之为模板,在Taq聚合酶作用下,经PCR扩增目的片段,使目的基因增加百万倍,经琼脂糖凝胶电泳后在紫外光下观察判定,实现对布鲁氏杆菌的快速检测。
【试剂盒组份】
1、试剂盒组成及贮藏条件
名称 20份 贮藏条件
1、0.2 mL PCR管 25个 冷藏
(A盒)
2、消化液 4ml
3、结合液 6ml
4、吸附柱 20个
5、收集管 20个
6、洗液 2*10ml
7、洗脱液 500µL
8、TAE缓冲液(50×) 20ml
9、阳性对照 50µL -20℃
(B盒)
10、阴性对照 50µL
11、PCR反应液 350µL
12、蛋白酶K 220µL
    2、有效期:6个月。
    3、需自备材料:生理盐水、组织研磨器、眼科剪、眼科镊、无菌注射器、无菌1.5mL离心管和吸头、琼脂糖、DL2000、染色液。
【操作步骤】
    一、样品制备
1、液体样品:采集血液获得血清或羊水、分泌物、乳汁、尿液等,低温保存送检;
2、组织样品:采集流产胎儿或生殖器官有明显病变组织样品1.0g,眼科剪剪碎于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,再加少量生理盐水混匀,4℃条件下8000rpm,离心1min,取上清于灭菌离心管中待检。
    3、样本要求:采样量要足够进行一次复检,运输、储存过程确保低温,尽量避免反复冻融,检测前需充分解冻。
    二、DNA的提取
    1、向无菌的1.5ml EP管中分别加入样品液100µL、消化液 200µL(用前37℃温育使之充分溶解),蛋白酶K 10µL充分混匀,56℃水浴30~60min;
    2、取出样品管,降到室温,分别加入结合液300µL,混匀,将全部液体加入套有收集管的吸附柱中(注意勿吸到杂质,以免堵塞柱子),12000rpm,离心1min;
    3、弃收集管液体,向吸附柱中加500µL DNA洗涤液,4℃条件下12000rpm,离心1 min;
    4、重复步骤3;
5、弃收集管液体,瞬离以彻底去除残留液体;
6、将吸附柱转入新的EP管中,柱中央滴加20 µL洗脱液,静置2min,4℃条件下12000rpm,离心2 min,EP管中液体即为DNA溶液;
    三、PCR扩增
    1、配液:取出PCR反应液,在室温融化后,瞬离,按15µL/管分装到PCR反应管中;
    2、加样扩增:分别向PCR管中加入5µL样本DNA或阴性对照或阳性对照,在PCR仪上运行以下程序:94℃ 5 min;94℃ 15 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35个循环;72℃ 7 min。
    四、电泳鉴定
    1、制胶:用50倍TAE电泳缓冲液稀释到1倍后配制适量1.0%琼脂糖凝胶;
    2、电泳:直接取5µL~10µL RT-PCR产物或DL2000直接点样于凝胶孔中,以5 V/cm电压于1倍TAE电泳缓冲液中电泳;
    3、染色、观察:将电泳好的凝胶放在加有染色液的1倍TAE缓冲液中浸泡数分钟,取出(小心污染)在紫外灯下观察结果,进行判定并做好检测记录。
【结果判定】
1、成立条件:阳性对照出现223 bp条带,阴性对照无目的带时,试验结果成立。
2、结果判定:被检样品出现223 bp条带为布鲁氏杆菌阳性;否则为阴性。
【注意事项】
    1、实验前请仔细阅读本试剂盒说明书,严格按操作步骤执行;不使用本试剂盒提供的组分或不按照说明书进行实验将可能导致错误结果。
    2、实验室管理应严格按照国家有关临床基因扩增实验室的管理规范执行。实验人员须为专业人员,实验过程应分区进行,每个阶段使用专用的仪器和设备;各区间人员流动及空气流向应有严格要求;实验用消耗品应有合理的清洁和质检程序,避免环境或物品污染PCR残留产物导致假阳性结果,避免核酸酶污染或扩增反应抑制物造成假阴性结果。
    3、所有病料相关容器应尽量洁净、无菌、低温条件保存;完成样本核酸提取后,建议马上进行下一步试验,短期可保存于-20℃,长期应保存在-70℃。
    4、操作台、移液器、离心机、耗材等仪器用品应经常用1.0%次氯酸钠或稀盐酸擦拭消毒或浸泡。实验房间、超净工作台应定期或每次实验后用紫外灯处理。
    5、所有试剂应在规定的温度储存,冻存试剂使用前应于室温下完全融化,使用后立即放回-20℃。
    6、染色液有毒,应于室温下避光保存,操作时应戴上手套,相应操作结束后手套要处理掉,不能再接触其它任何物品,以减少污染区。
    7、注意防止试剂盒组分受污染。试剂盒间成分勿混用,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。
    8、实验产生的废弃物、标本及提取物等应及时收集,远离PCR实验室才能进行无害化处理。

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