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高致病性与经典蓝耳病毒株复合RT-PCR鉴别检测试剂盒

高致病性与经典蓝耳病毒株复合RT-PCR鉴别检测试剂盒
【产品名称】
     通用名称:高致病性与经典蓝耳病毒株复合RT-PCR鉴别检测试剂盒
     英文名称:Diagnostic Kit for HP-PRRS and LP-PRRS strains (RT-PCR)
【预期用途】
本试剂盒主要用于检测疑似感染猪血清及临床病料中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV,Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus),即蓝耳病病毒,适用于PRRSV的检测、诊断和流行病学调查。该试剂盒能够鉴别高致病性与经典蓝耳病毒毒株。

 

【检测原理】
    本试剂盒采用柱式法提取RNA,并以之为模板,针对PRRSV基因组非结构蛋白Nsp2编码区缺失导致致病性PRRSV与非缺失30个氨基酸的经典PRRSV的特性分别设计特异性引物,采用一步法RT-PCR实现反转扩增目的片段,使之增加百万倍,经琼脂糖凝胶电泳、染色后,在紫外灯下观察目的条带的有无实现对高致病性与经典蓝耳病毒毒株的快速鉴别诊断。
【试剂盒组份】
    1、试剂盒组成及贮藏条件
名称 20份 贮藏条件
1、0.2 mL PCR管 25个 冷藏
(A盒)
2、吸附柱 20个
3、收集管 20个
4、裂解液 10 ml
5、洗液 2*10ml
6、洗脱液 500µL
7、TAE缓冲液(50×) 20ml
8、阳性对照 50µL -20℃
(B盒)
9、阴性对照 50µL
10、RT-PCR反应液A 120µL
11、RT-PCR反应液B 240µL
    2、有效期:6个月。
    3、需自备材料:生理盐水、组织研磨器、眼科剪、眼科镊、无菌注射器、无RNA酶的1.5ml EP管和吸头、琼脂糖、DL2000、染色液。
【操作步骤】
    一、样品制备
1、拭子样品:用棉拭子沾取动物精液、粪便等,置于生理盐水中搅拌,低温保存送检;
2、组织样品:采集有明显病变的淋巴结、脾脏、肺脏或胎儿等组织样品1.0g,眼科剪剪碎于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,再加少量生理盐水混匀,4℃条件下8000rpm,离心1min,取上清于灭菌的离心管中待检。
    3、样本要求:采样量要足够进行一次复检,运输、储存过程确保低温,尽量避免反复冻融,检测前需充分解冻。
    二、病毒RNA的提取
   1、向无RNA酶的1.5ml EP管中分别加入样品液200µL、裂解液 500µL,颠倒混匀,静置2~3min;
    2、将液体转入套有收集管的吸附柱中(取上清液避免堵塞柱子),12000rpm离心1min;
    3、弃收集管液体,向吸附柱中加500µL洗液,12000rpm离心1min;
    4、重复步骤3;
    5、弃收集管液体,瞬离以彻底去除残留液体;
    6、吸附柱转入新的无酶EP管中,柱中央滴加20µL洗脱液,室温静置2min,12000rpm离心1min,EP管中液体即为RNA溶液;
    三、RT-PCR
    1、配液:取出RT-PCR反应液,在室温融化后,瞬离,按照每份RT-PCR反应液A液5µL,RT-PCR反应液B液10µL的比例预混两种反应液,按15µL/管分装到PCR反应管中;
    2、加样RT-PCR:分别向PCR管中加入5µL样本或阴性对照或阳性对照RNA,在PCR仪上运行以下程序:42℃ 30 min,95℃ 5 min;94℃ 15 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35个循环;72℃ 7 min。
    四、电泳鉴定
    1、制胶:用50倍TAE电泳缓冲液稀释到1倍后配制适量1.0%琼脂糖凝胶;
    2、电泳:取5µL~10µL 扩增产物或DL2000直接点样,以5V/cm电压于1*TAE缓冲液中电泳;
    3、染色、观察:将电泳好的凝胶放在加有染色液的1倍TAE缓冲液中浸泡数分钟,取出(小心污染)在紫外灯下观察结果,进行判定并做好检测记录。
【结果判定】
    1、成立条件:阳性对照出现400bp 和264bp两条条带,阴性对照无目的带时,试验结果成立;
    2、结果判定:被检样品出现400bp条带为高致病性毒株阳性;被检样品出现264bp条带为经典毒株阳性;被检样品400bp和264bp两个条带同时出现为双阳性;否则判定为阴性。
【注意事项】
    1、实验前请仔细阅读本试剂盒说明书,严格按操作步骤执行;不使用本试剂盒提供的组分或不按照说明书进行实验将可能导致错误结果。
    2、实验室管理应严格按照国家有关临床基因扩增实验室的管理规范执行。实验人员须为专业人员,实验过程应分区进行,每个阶段使用专用的仪器和设备;各区间人员流动及空气流向应有严格要求;实验用消耗品应有合理的清洁和质检程序,避免环境或物品污染PCR残留产物导致假阳性结果,避免核酸酶污染或扩增反应抑制物造成假阴性结果。
    3、所有病料相关容器应尽量洁净、无菌、低温条件保存;完成样本核酸提取后,建议马上进行下一步试验,短期可保存于-20℃,长期应保存在-70℃。
    4、操作台、移液器、离心机、耗材等仪器用品应经常用1.0%次氯酸钠或稀盐酸擦拭消毒或浸泡。实验房间、超净工作台应定期或每次实验后用紫外灯处理。
    5、所有试剂应在规定的温度储存,冻存试剂使用前应于室温下完全融化,使用后立即放回-20℃。
    6、染色液有毒,应于室温下避光保存,操作时应戴上手套,相应操作结束后手套要处理掉,不能再接触其它任何物品,以减少污染区。
    7、注意防止试剂盒组分受污染。试剂盒间成分勿混用,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。
    8、实验产生的废弃物等应及时收集,远离PCR实验室才能进行无害化处理。

 


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